一、细胞简介

细胞简介

L-WRN 是一种从雄性小鼠的乳晕中分离出来的成纤维细胞样细胞。 该细胞系是生产 Wnt-3A、R-spondin 3 和可用于培养各种哺乳动物组织干细胞的头蛋白条件培养基的来源。L-WRN 细胞是通过用 R-spondin 3 和 noggin 共表达载体 转染 L-Wnt3A (ATCC® CRL-2647) 获得的，并在含有 G418 和潮霉素 B 的培养基中选择稳定的克隆。L-WRN 细胞将因子 Wnt3A、R-spondin 3 和 noggin 分泌到培养基中。Wnt3A 结合 frizzled 受体家族并激活 β-连环蛋白依赖性转录。r-spondin 蛋白家族的成员是肠道中典型 Wnt 信号传导的有效共激活剂，对于分离小肠干细胞至关重要。Noggin 是一种骨形态发生蛋白 (BMP) 信号抑制剂，能够在体外维持和传递小肠类器官。虽然这三个因素是可商购的，但维持目前使用永生化细胞系的标准测定所需的大规模培养物的成本很高。与用重组蛋白制成的培养基相比，使用来自 CRL-3276 的条件培养基可提供相对完整和高效价的蛋白质，是一种具有成本效益的替代方案。

细胞名称

L-WRN（小鼠皮下结缔组织细胞）

细胞别称

L-Wnt3a/R-spondin/Noggin

细胞货号

HBCC17114

来源

C3H；皮下结缔组织；脂肪; 乳晕  

细胞形态

成纤维细胞样

生长特性

贴壁生长

培养条件

DMEM培养基；优质胎牛血清+10%；0.5mg/mL G-418；0.4mg/mL hygromycin B(潮霉素B)

培养环境

气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

二、细胞复苏方法

复苏步骤

1、将冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻；
2、加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀；
3、在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞；
4、将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养；

三、细胞传代方法

传代比例

1:2（具体情况视细胞生长速度及密度决定）

传代方法

1、尽量吸干净T25瓶原培养基；
2、用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，吸走润洗的PBS；
3、加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）；
4、将培养瓶放入37度培养箱消化（1到2分钟，难消化的细胞适当增加时间）；
5、消化到细胞大部分变圆并脱落，轻敲培养瓶后加入3-4ml完培终止消化；
6、混匀细胞吸出，1000rpm离心3-5min，弃上清；补加1-2ml完培吹匀；
7、按1:2分配到新的培养瓶中，添加6-8ml完培保持细胞生长；

注意事项

不同品牌胰酶消化时间差别较大，可根据细胞形态判断消化进程

四、细胞冻存方法

冻存液配方

冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配（推荐使用DELF无血清非程序细胞冻存液HBCC16090进行冻存细胞，快速，便捷）。

冻存规格

按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

冻存方法

1、消化并离心收集细胞，计数，推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml；
2、将细胞悬液尽快移入已经做好标记的冻存管；
3、将冻存管转入程序冻存盒，放入-80度冰箱过夜，第二天转入液氮保存；没有程序冻存盒的实验室，加入细胞后可以将冻存管放在泡沫盒中4度静置5-10min，再-20度静置2h后转入-80度过夜，第二天转入液氮保存;

五、注意事项

注意事项

1、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2、建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。

3、本产品仅限于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用。